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          飼料有效賴氨酸測定方法

          發(fā)布: 2012-10-07 | 來源:★農(nóng)富康直銷官方網(wǎng)站--EM菌種|發(fā)酵床菌種|水產(chǎn)EM菌液|EM原露|秸稈飼料發(fā)酵青貯劑 | 編輯:nfkkj | 查看:
          1主題內(nèi)容與適用范圍

            本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中有效賴氨酸的測定方法。

            本標(biāo)準(zhǔn)適用于含有動(dòng)物或植物性蛋白質(zhì)的配合(混合)飼料及單一飼料。

            2引用標(biāo)準(zhǔn)

            GB6432飼料粗蛋白測定方法

            3術(shù)語

            有效賴氨酸是指在規(guī)定的測定條件下測得的總賴氨酸和非有效賴氨酸之差。

            4原理

            蛋白質(zhì)中有效賴氨酸的ε-氨基可與2,4-二硝基氟苯反應(yīng),酸解后生成二硝基苯賴氨酸,而其他非有效部分則生成賴氨酸。因此將不經(jīng)二硝基氟苯處理的樣品和經(jīng)由二硝基氟苯處理的樣品分別水解,用離子交換色譜法測定各自的賴氨酸含量,即可由其差值得出樣品中有效賴氨酸的含量。

            5試劑和溶液

            本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純,水為去離子水。

            5.1乙醚(HG3-1002)。

            5.2碳酸氫鈉(GB640)溶液:80g/L。

            5.32.4-二硝基氟苯(DNFB)乙醇溶液:

            將一定量的DNFB溶于95%乙醇,其體積比為0.15∶12,該溶液用前現(xiàn)配。

            5.4鹽酸(GB622)溶液:6.0mol/L。

            5.5鹽酸(GB622)溶液:6.5mol/L。

            5.6稀釋用檸檬酸鈉緩沖液:pH約2.2。

            將下列試劑依次溶于適量水:

            20g水合檸檬酸(HG3-1108)

            8g氫氧化鈉(GB629)

            16mL濃鹽酸(GB622)

            0.1mL辛酸

            20mL硫二甘醇

            加水稀釋至1000mL。

            5.7層析用檸檬酸鈉緩沖液:

            pH值及配制方法依不同型號的氨基酸測定儀有所區(qū)別,請參見儀器說明書配制。

            5.8茚三酮試劑

            按儀器說明書配制。

            5.9賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)液:50nmol/mL或其他濃度。

            先配制2.5μmol/mL賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液:稱取45.6mg賴氨酸單鹽酸鹽溶于0.1mol/L的鹽酸中,稀釋至100mL,混勻。

            用該標(biāo)準(zhǔn)貯備液或商品2.5μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液,以pH2.2檸檬酸鈉緩沖液為溶劑配制50.0nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液。也可根據(jù)儀器說明書配制成其他最佳使用濃度。

            6儀器、設(shè)備

            6.1實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī):能快速一致地粉碎樣品并能避免樣品過熱和盡可能少與外界接觸。

            6.2樣品篩:孔徑0.25mm(60目)。

            6.3分析天平:感量0.0001g。

            6.4油。簻囟瓤煞(wěn)定于120~130℃之間。

            6.5回流水解裝置:150mL、500mL短頸燒瓶以玻璃磨口接頭與回流冷凝器(長約35~40cm)相接。

            6.6離心機(jī):4000r/min。

            6.7旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

            6.8氨基酸自動(dòng)分析儀。

            6.9回流水解裝置:50mL水解管或消煮管,具磨口接頭與回流冷凝器相接。

            6.10金屬塊消煮爐:要求溫度保持在120~130℃之間,必要時(shí)可加繼電器和接點(diǎn)溫度計(jì)控制。金屬塊內(nèi)消煮管的受熱深度應(yīng)高于或等于25mL消煮液的液面高度。

            6.11水浴

            7試樣制備

            采集具代表性的配合(混合)飼料或單一飼料,按四分法縮分制備實(shí)驗(yàn)室樣品,取10~20g粉碎,使其全部通過樣品篩(6.2)。充分混勻,裝入密閉容器。

            8分析步驟

            8.1A法

            8.1.1總賴氨酸

            8.1.1.1酸水解

            稱取約含50mg粗蛋白質(zhì)的樣品兩份,置于500mL燒瓶(6.5)中,加入250mL鹽酸(5.4),裝好回流冷凝器,置120~130℃油浴(6.4)中,使其徐徐沸騰,回流水解24h。

            取下燒瓶,冷卻。必要時(shí)將酸解液(連同水解后不溶物)重新定容至250mL。過濾,吸取5mL濾液,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(6.7)上,60℃左右蒸發(fā)至干。加水少許,重復(fù)蒸干1~2次。

            將殘?jiān)苡?mL稀釋用檸檬酸鈉緩沖液(5.6),離心10min(4000r/min),取上清液上機(jī)或貯于具塞小管中冷藏備用。

            8.1.1.2測定

            打開氨基酸自動(dòng)分析儀(6.8),使柱溫,反應(yīng)浴溫度,緩沖液及茚三酮流速等各種操作參數(shù)達(dá)到預(yù)定要求,并按儀器說明書取一定量的賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(5.9)進(jìn)行校準(zhǔn)。然后在同樣條件下取8.1.1.1中所得之樣品溶液進(jìn)行測定。

            8.1.2非有效賴氨酸

            8.1.2.1二硝基苯化反應(yīng)

            稱取約含50mg粗蛋白的樣品兩份,置于150mL燒瓶(6.5)中,加入4mL碳酸氫鈉溶液(5.2),放置10min,其間需不時(shí)振搖。再加入6mLDNFB乙醇溶液(5.3),加蓋,振搖,注意勿使樣品顆粒粘附于瓶壁上。在室溫下暗處放置過夜。

            8.1.2.2純化

            在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上,溫度不高于40℃條件下,將上述反應(yīng)物蒸干,加入35mL乙醚(5.1),振搖或攪拌后,待固體充分沉降,棄去絕大部分乙醚,小心不要帶出固體樣品顆粒。重復(fù)上述操作兩次,每次加25mL乙醚(此步驟乙醚層有時(shí)似較渾濁,只要傾倒時(shí)不帶出樣口顆粒,可不必離心)。最后,蒸發(fā)除去殘存乙醚。

            8.1.2.3酸水解

            邊沖洗瓶口瓶壁邊加入75mL鹽酸(5.4),使樣品全部浸于酸中,裝好回流冷凝器,置于120~130℃油浴中,使其徐徐沸騰,回流水解24h。

            取下燒瓶,冷卻。將水解物定量轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,用水定容,過濾。吸取5mL濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上,60℃左右蒸發(fā)至干,加水少許,重復(fù)蒸干1~2次。

            將殘?jiān)苡?mL稀釋用檸檬酸鈉緩沖液(5.6),用離心機(jī)(6.6)離心10min,取上清液上機(jī)或貯于具塞小管中冷藏備用。

            8.1.2.4測定

            同8.1.1.2。

            非有效賴氨酸峰值較低,易受鄰峰或雜峰干擾,如某些氨基酸自動(dòng)分析儀該峰分離不好,需將樹脂床(或分析柱)加長,或變換參數(shù)與程序。

            8.2B法──簡化法

            8.2.1總賴氨酸

            準(zhǔn)確稱取約含50mg粗蛋白質(zhì)的樣品雙份,置于50mL水解管中,加入25mL鹽酸(5.4),裝好回流冷凝器并置于預(yù)先熱至120~130℃金屬塊消煮爐(6.10)上,緩緩煮沸水解24h。

            冷卻,將水解液定容至50mL,混勻,過濾。吸取濾液2mL,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,60℃濃縮至干,加水少許,重復(fù)蒸干1~2次。

            殘?jiān)屑尤脒m量稀釋用檸檬酸鈉緩沖液(5.6),(粗蛋白質(zhì)含量為10%~20%的樣品加2mL,粗蛋白質(zhì)含量為30%~50%的加5mL),充分溶解后離心,取上清液上機(jī)。

            8.2.2非有效賴氨酸

            8.2.2.1二硝基苯化反應(yīng)

            稱取約含蛋白質(zhì)20~25mg的樣品雙份,置于50mL水解管中,加入2mL碳酸氫鈉溶液(5.2),放置10min(其間不時(shí)振搖),加入DNFB乙醇溶液(5.3)3mL,振搖混勻后,在室溫下暗處放置過夜。

            將上述水解管置85~90℃水浴中蒸去乙醇,直至振搖時(shí)不產(chǎn)生泡沫為止。此時(shí)水解管內(nèi)物應(yīng)失重2.5~3g。

            8.2.2.2純化

            于去醇后的水解管內(nèi)加入2mL乙醚(5.1),加塞,劇烈振搖后令其分層,棄去乙醚層,再用乙醚萃取兩次,每次10mL,棄去醚層后,將水解管放入60~70℃水浴,除去殘存乙醚。

            8.2.2.3酸水解

            邊沖洗管口管壁邊加入23mL鹽酸(5.5)裝好冷凝器,與測總賴氨酸樣品一道置120~130℃金屬塊消煮爐(6.10)上,回流水解24h。

            冷卻,將水解液定容至50mL,混勻,過濾。吸取濾液5mL于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干,加水少許,重復(fù)蒸干1~2次。

            殘?jiān)屑尤脒m量稀釋用檸檬酸鈉緩沖液(5.6)(蛋白質(zhì)含量10%~20%加3mL,30%~50%加5mL),充分溶解后離心,取上清液上機(jī)。

            9分析結(jié)果的表述

            9.1總賴氨酸

            樣品中總賴氨酸含量W1,以其質(zhì)量百分率表示,即:

            ……(1)

            式中:A──每毫升上機(jī)液中賴氨酸含量,ng;

            m1──樣品質(zhì)量,mg;

            D──稀釋倍數(shù)。

            9.2非有效賴氨酸

            樣品中非有效賴氨酸含量W2,以其質(zhì)量百分率表示,即:

            ……(2)

            式中:A──每毫升上機(jī)液中賴氨酸含量,ng;

            m2──非有效賴氨酸測定中樣品質(zhì)量,mg;

            D──稀釋倍數(shù)。

            9.3有效賴氨酸

            樣品中有效賴氨酸含量W3,以質(zhì)量百分率表示,即:

            有效賴氨酸W3=W1-W2……(3)

            若有效賴氨酸含量以其在總賴氨酸中的質(zhì)量百分率表示,則

            W3(%)=〔(W1-W2)/W1〕×100……(4)

            10重復(fù)性

            同一試樣兩平行測定值的相對相差,應(yīng)不超過其平均值的10%。

            注:與生物測定法相比,本法測定結(jié)果偏高,在分析評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)需加以注意。

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